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网友分享五年western blot 的实验经历
点击次数:252 发布时间:2019-02-22

网友分享了他在从2005年次见到抗体到2010年间五年western blot 的实验经历。五年里,太多的磨难,太多的惊喜,太多的感触,太多的代价,让其对于western blot实验有了独到深刻的见识.

1、抗体的选择  

对于国内的大多数实验室来讲,做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单,买进口抗体捉襟见肘,买国产抗体得需要大无畏的勇气,对于我所在的兰州地区的实验者而言,感触尤深。在这五年的western blot实验历程里,我先后用过进口抗体,进口抗体国内分装包装,国产抗体,质量良莠不齐。

进口抗体一般不会出现闪失:abcam品种全,质量过硬,但价高(3400元/100微升),而且说是100微升,但至多能吸出来90微升;Sigma的价最贵;比较有性价比的是CST的抗体,现在好像是2200元/100微升,我前后用过二十几种, 1:1000的稀释比下,还没有失过手,100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验,还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升,唯yi的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以,但是选用Santa的单抗还是有风险,估计这也是业界共识了吧。  

进口抗体国内分装包装我也用过不少,呵呵,毕竟是穷人(420元/100微升),大概好抗体的比例约为50%,如果能做出来,也存在一个问题,就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对(抗体品种,货号等完全一致),在都能做出来的前提下,原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年,不敢说出来,我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖,也会有所不同。揣测归揣测,假如只为了发lun文毕业走人,可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。  国产抗体比较知名的就几家,但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多,而且杂带多,背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化,怎么说呢,应付硕士论文够了。

我也帮别人自制过抗体,再用抗原 亲和纯化。效价非常不错,夸张的时候1:10000都能做出条带,唯yi的麻烦是兔子太骚(骚臭),不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲,老板又特别想拥有手工作坊的情况下,可以自己伺候折腾兔子来玩玩,刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗,是不是可以写成论文毕业,估计因校而异了。

2、Western Blot设备  

目前最hao的垂直槽和转移槽还是Biorad(伯乐),尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶,但通常用不上,由此造成垂直缓冲液的浪费,而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽,容易漏液,塑料夹应该是有疲劳寿命的,估计日子一长,弹性就会改变,所以如果你们实验室刚买了MINI4,赶紧用,遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。  

Biorad的一套系统得两万多,西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明,上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样,而且可以通用,不带电泳仪 是5千多一套,挺好用的。唯yi的不足是塑料寿命不如伯乐,胶架容易断裂。不过仔细算算,三套天能也就是一套伯乐的价格,值了。北京六一的垂直槽很转移槽很好用,但垂直槽配胶不方便,玻板太厚,散热不好,但能用,六一的电泳仪(电源)还是很好用的。

3、Western Blot实验条件  

Western Blot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的。具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货,配出来的胶可以提在手里玩,弹性非:,价格比sigma的便宜许多,1公斤好像是480多人民币,够实验室用好长时间,现在我们实验室做双向电泳都用biomol的胶,很好用。Marker我现在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了,兰州的代理是上海生工。  

要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用,具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。  

转膜我通常是快转两百200毫安/2小时,慢转80毫安/12小时。快转是一定得做冰水。?褪前巡圩优菰诒??旌弦豪。  

封闭我通常用BD的脱脂奶粉,不归,260元500克,也是从北京华美买的。  

ECL我用pierce的,500毫升1650元,比国产的还便宜好用。  胶片是柯达的,以前用过乐凯的,不如柯达。  我很少用丽春红或考马斯染膜或染胶,总觉得是脱裤子***的事。

4、Western Blot实验关键

Western Blot操作步骤多,每一步的失误都会造成全盘失败,综合而言,抗体仍然是决定成败的关键,如果抗体很滥,就是神仙也没招。其中内参抗体很重要,因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。Actin,Tubulin,GAPDH我都用过,Actin,Tubulin的缺点是有时候会出现复带,比较稳定的还是GAPDH。如果用心看看cell,nature,science上的文章,大多用GAPDH做内参。进口的,国内分装的,国产的,我都用过。进口的最qiang的1:10000都能做出条带(Upstate,现在被Minipore招安了),国内分装的也好用,但就是不好回收重复使用,国产的一般只能用一次。

我要特别强调的是,实验室里最贵的抗体实际上是内参抗体,因为只要Western Blot开工,每次都得用内参抗体,而一般目的蛋白的抗体也就用几次,重复三次就了事。但内参抗体是不折不扣的耗材,严格意义上将,每跑一次胶,就得杂一次内参,使用频率最高决定了内参是最花钱的抗体。我也自己制备过内参抗体,但好像因为种属同源性太高,背景总是不干净。进口的好,太贵;国产的只能使用一次,年终算账,不比进口的便宜。

我自己的体会是多抗制备并不是技术含量极高的事,为什么国内企业高的早不了,低的造不好呢?现在我用的是杭州贤至的GAPDH兔多抗,200微升420元钱,我在蛋白上样量12微升/孔的情况下,按1:2000稀释比,条带非常清晰,没有杂带,是我目前用过的最hao的国产抗体,我估计按1:4000照样能做出来,因为按按1:2000稀释做,在暗室里点上ECL后肉眼清楚地看到荧光条带。抗体我在不加die氮化钠的情况下4度过夜杂交,可回收重复使用5到6次。

最早我是2008年在丁香通上看到了杭州贤至(当时名叫杭州松华)发布的广告,我就怂恿实验室主管买了2支,很好用,现在实验室都没有用完 ;2009年我的一个朋友做western,我推荐他又买了1支,做出来的效果确实好,2009年底我到了新的实验室,western的全套我在新实验室重新建立,啥都采购齐了,可就是买不到杭州松华的内参抗体,我上网再也找不到这个公司的网页了,没办法,只好一直噌朋友的内参抗体用。

我有个陋习,就是实验中用顺了用稳定了试剂轻易不愿意更换品牌。还好,今年7月份我终于找到了当年的通讯记录,一联系才知道他们改名叫杭州贤至生物科技pk10网站了,呵呵,改了个名,害我找了大半年。第三次买到的GAPDH内参抗体,还是好用,1:2000,条带清晰,回收重复用,照样work,截止目前,我的新导师对我采购的一堆试剂还没有不满意的,嘿嘿!草根出生,我也照样有我穷人的劳斯莱斯。

5、关于奶粉,膜的选择和显影定影

奶粉看似简单,其实很重要,如果要凑合,可以到超市买光明的脱脂奶粉。奶粉质量不好,会最终导致显影要么漆黑一片,要么啥都没。fluka的很好,可惜因为疯牛病的原因,现在海关禁止进口美国牛制品。我现在用的bd的,很好很稳定,如果回收使用,500可以用很长时间。细菌达到一定极限后,会导致tbst里的奶粉***变质,表现为发绿发臭,一种肉眼可察觉的淡淡的绿,一种鼻子凑过去能嗅出的臭,这时候就得扔了。

nc膜,pvdf膜我都用过,现在我已经固定下来用密理博的0.45微米的pvdf膜。pvdf膜的好处是蛋白载量大,韧性好。唯yi的麻烦是事先得用甲醇泡几分钟,目的好像是为了增强膜的正电荷。甲醇泡完后,得在转移缓冲液里泡一两分钟。国内用nc膜的人多一些,主要是因为nc膜有分装的小片,忽悠老板买一张膜就100元钱,老板肯定乐意,若是说膜得花上千元,老板就有可能长时间的***思考,然后过些日子再答复你。

所以大多数人会采取前一种方式,当然得告诉老板好几次,膜就100元钱。我次用到pvdf膜是和好几个实验室合资买了一卷,我出了475元,类似于打的拼车的方式。现在pvdf膜国内大概是1600元到1700元一卷,33厘米*375厘米,够好几个人用好长时间了,膜假货不多,至少我没有见过。我们几个拼车的穷弟兄拿着尺子分赃的时候才发现本地供货商给我们送的货少了80厘米,嘿嘿,穷鬼撵着杀叫鬼,我们花钱容易吗!所以交涉,再交涉,直到他把我们的血汗膜返还才罢休。现在我基本是从北京的欣津科和华美买,大概1700元一卷,完完整整。

0.45微米的pvdf膜我用5%的脱脂奶粉(溶于tbst中)室温封闭1小时,0.22微米的用8%的脱脂奶粉。bsa我很少用,主要是bsa会出现封闭不均匀的情况。我也很少用0.22微米的膜,原因是背景不干净,再者无论是封闭时间还是洗膜时间都得延长。标准教程上推荐20kd以下的分子用0.22微米的膜,我杂过最小的分子是cleaved-caspase3,12ka,按我在一楼的转膜条件,在0.45微米的膜上清清楚楚。我在上海的师弟他们转7ka的分子也用0.45微米的,没出过事。废话一句,我师弟的实验室可是国家重点,那个富呀,让我闭上眼想想吧,那可是屎壳郎掉到了化粪池的感觉。

一抗我一般4度摇床过夜,洗膜3此,每次5分钟。要注意的是,如果一抗里添加了die氮化钠,务必洗膜5次,每次10分钟,因为die氮化钠会灭活二抗偶联的辣根过氧化物酶(hrp)活性。二抗我用的是中杉金桥分装的,120元一支,通常1:5000,室温1小时,然后洗膜三次,每次5分钟。

奶粉,一抗,二抗,我都回收,从开始到现在,一直如此。因为我不敢忘记自己贼的出身。我的一抗是国外的一位老师送给实验室的,刚开始的半年我啥都做不出来,以至于导师在平安夜领我到教堂祈祷。上海的师弟知道后,每次裁膜的时候给我一小片一小片日积月累了一些,二抗只拿到了10微升,我怕实验室的人发现,一直是熬夜做western。可最终还是因为我自己嘴不牢靠,导致东窗事发,师弟险些被开除,事情败露的那天,师弟在长途电话的那边哭,我在这边哭,写着写着,我的眼泪又一次的盈眶而出,说不出的辛酸与悲凉,师弟说他承担一切责任,让我装作不知道,那天晚上,我给他的导师写了一封长信,只求能保住师弟。

老天保佑,他导师让师弟写检查认错。那以后,我再也没有让师弟为我偷过东西,我不能再为自己的理想让朋友付出代价。虽然现在实验室的老板比较大方,我依然坚持着回收试剂的习惯,我始终不能忘记自己western blot的开始。

一般8.3*4.3厘米的膜,大概要400微升的ecl混合液。加ecl我一般就在灯光下,或者白天把窗帘拉上。加好ecl,覆上保鲜膜后,我才端着暗盒进暗室,暗室里我的暗室红灯始终开着,没有那么可怕。在暗室里,我一般是剪4张同样尺寸的胶片,叠在一起,压在膜上方,暗盒一扣,就干别的事情去了。5个小时或过夜,我再把胶片显影,显影我起初很注意技巧,但现在基本上是在显影液里放10分钟,捞出来放到水盘里涮一涮,然后在定影液里放十分钟。我一般总能找到一张理想的胶片,因为胶片叠加到一起后,层层屏蔽,从而逐渐递减荧光强度,我试过多次,即便是荧光强度最qiang的内参,也至多能达到最上面的第四层胶片。所以显定影后,肯定有曝光过度的胶片,但也肯定有趋势,背景,强度恰到好处的一张,嘿嘿,傻瓜做法。

傻瓜做法看似呆笨,实则不然。我在很长的一段时间里,都是读秒,或三分钟,或15分钟,或半小时,或1小时取出胶片显影,眼睛紧紧盯着,一看到条带就捞出来定影。如果不理想,再压胶片,再等,再取再投再捞,活脱脱是个“猴埋儿”。

西北人传说小猴夭折了,母猴把小猴埋到土里面,一会又挖出来,再埋进去,又挖出来...反复无止。显定影时如果采取猴埋儿式的技巧,是最费胶片,最费时间,最费心力的做法。所以我是傻瓜就用傻瓜的办法。

我用过好几个品牌的国产ecl,和进口的ecl也做过对照。国产的一半是a液b液总共50毫升180元钱,单价3.6元/毫升,一般肉眼可见的荧光强度可持续1个小时,pierce和milipore的可以持续3小时。milipore的麻烦之处在于由a液b液c液三组成分组成,费枪头,费脑zi。现在我固定使用pierce的super ecl,1650元500毫升,折算下来是3.3元/毫升。上海吉泰是代理。好像分子克隆上写出了ecl的配方,技术含量并不高,

胶片我用过医院放射科的,乐凯的,柯达的,柯达现在小胶片(小暗盒尺寸)好像是130元/50张,乐凯的是其价格的一半。乐凯的缺点在于胶片容易出现划痕,有莫名奇妙的背景,虽然瑕不掩瑜,但还是让人不爽,再就是感光不如柯达的灵敏。这些我都比对过。如果细心地把二者胶片厚度比比,也可看出差距。我就此请教过甘肃的乐凯总代理,他说根源出在牛身上。

显影液定影液我一直用乐凯的,便宜,量又足,谁用谁说好。进口的从未染指,连想都没想过,呵呵,我内心里还是极其渴望支持国货的,爱之深,恨之切啊!

6、后记

从2005年次见到抗体到现在,我已经做western blot实验整整五年了。五年里,太多的磨难,太多的惊喜,太多的感触,太多的代价。现在我做博士后,我指导的学生也能一次就上手,虽然他们也会出错,但我很少责备他们,因为我知道自己的路途也并不顺利,如果过度的责难他们,会让他们失去信心,而且更严重的是会导致他们遮遮掩掩,我从来不怕实验做不出来结果,就怕查不出失败的原因。

我喜欢western blot技术,甚至偏爱或痴迷。最夸张的时候是一天连跑带转了八张膜,实验最不顺利的那两个月我天天就睡在实验室里,有时候三天三夜不睡觉。我不知道自己借了多少钱从丁香园的二手资源版淘过别人用剩的抗体,至今我穿的最贵的裤子也就80元钱,但花1000元买抗体我从来没有觉得破费。好在我的家人和朋友们理解我,支持我,让我能逐步实现自己的愿望。五年里,从器具,试剂,仪器,甚至如何用滤纸,我都形成了自己独有的体系和诀窍,我的一切东东都有品牌,这些品牌组合起来就是穷人的劳斯莱斯。

回想过去,内心仍然会浸没到悲凉与辛酸中。最难受的时候是做p21抗体,整整半年,从丁香园淘了五个品牌的抗体,都做不出来。最后逼着导师买cst的抗体,还是不出,那时候正好是2008年雪灾,抗体在公路上走了半个月,我收到抗体是大年初二,兴奋地上样,转膜,还是没有,当时我感觉自己就好像浸没在冰窖里。宿舍里暖气不好,第二天我起床时,房子里的洗脸水都已结冰,和我的心绪一模一样。

好在上海吉泰是一级代理,让我投诉,cst美国总部发回来他们的蛋白阳性对照品,再试,p21出来了,技术支持是个印度人,一眼就看出来我没有用超声波裂解。我们实验室没有这个东东,我怎么就想不到问题就出在这呢!从投诉到解决问题又是两个月。因为western,造成我博士延期一年半,害得师弟差点被开除,这也是我主动和导师关系疏远的开始。

但我还是痴迷western,在我心里,western blot技术本身就是穷人的劳斯莱斯。跑一次胶,我一次可以在两张膜上裁切出13种分子,我想不出还有哪项技术能一次实现如此之多的指标。Western稳定,直观,看着胶片上那粗细浓淡变化的条带,就好像自己置身细胞内部,看着那些分子组合跳舞。我内心里一直非常感激当年馈赠抗体的那位老师,是他让我踏上了信号转导的道路,也是因为western,我一度和他几乎决裂。在做western之前,我看文献几乎只看review,因为我看不懂实验性论文的图片,也正是做western,我才开始真正的踏上科研道路。

我逐渐能看懂IP,CO-IP,EMSA,CHIP,我有了更多的梦想与愿望。五年中,我最得意的是陪着western blto的发明人乔治斯塔克(George R. Stark)院士去敦煌玩,老头年过70,动过心脏手术不久,仍然坚持赤脚爬上陡峭的鸣沙山。我们登顶歇气时,老头一声不吭地又从山顶一步步走下去,从半山腰挖什么东西,等他再上来,我们才看清楚,他手里拿着两个游客随地扔弃的矿泉水瓶子。老头一直把那两个国货拎到了山下的垃圾箱里。这是老头给我最深刻的记忆,境当谋高远,一个人的精神境界决定了他专业道路的高远。

从western实验我总结出,实验上根本省不下来钱,一个环节的烂huo就会导致全盘失败。对于实验设计而言,也是如此,一个步骤的bug会导致整个实验立题和评估的逻辑混乱。如果要追求性价比,也就是如何发挥穷人的劳斯莱斯的最大收益,那从一开始就要按秋后算账的原则选择试剂,要算总账;如果要让实验顺顺利利,那就得注意每一个环节,步步为营,细节决定成败。到现在,只要抗体work,几乎没有我做不出来的分子,western给了我无穷的自信。

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