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石蜡切片或细胞的原位杂交实验
点击次数:16 发布时间:2019-08-30
实验材料

石蜡切片

试剂、试剂盒

HCl二甲苯乙醇SSCPBS链霉蛋白酶甘氨酸DTTRNA酶消化液乙酸铵

仪器、耗材

染色盘加湿盒载玻片烘箱水浴锅培养箱

实验步骤

1.  准备脱蜡/再水化系统(可重复使用数次)及0.2 mol/l HCl同时,将载有切片样品的载玻片(玻片盒中,于-20℃或-70℃贮存)置室温。开始预热2×SSC至70℃(步骤5中使用)。

 

2.  在加有二甲苯的染色盘中进行切片脱蜡,更换二甲苯3次,毎次同隔2 min(对载有未经包埋单细胞的玻片则无必要)。 


3.  通过如下各组染色盘进行再水化。100%乙醇2次,每次2 min;95%乙醇2 min;70%乙醇2 min,50%乙醇2 min。 


4.  样品室温下于0.2 mol/l HCl中变性20 min。

5.  样品在70℃ 2×SSC中热变性15 min,浸于1×PBS,2 min。

 

6.  在新配制的4%PFA固定液中进行样品后固定,置室温5 min。于3×PBS中终止固定3 min,继以1×PBS浸2次,每次30 s。


7.  在含10 mmol/l DTT的1×PBS中平衡样品,置45℃水溶10 min。

 

五分pk拾8。  以新配制的封阻液进行封闭。置45℃水浴30 min,水浴时用铝箔覆盖(碘乙酰胺对光敏感)。

 

9.  室温下,以1×PBS浸洗2次,每次2 min。

 

10.  于新配制的TEA缓冲液中,平衡样品2 min,移玻片架于新的TEA缓冲液中,并加 乙酸酐至0.25%终浓度。快速混合,并在搅拌情况下,浸泡玻片5 min。再加乙酸酐至0.5%终浓度,再浸泡5 min。

11.  样品移至2×SSC中浸泡5 min。

 

12.  分别以50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇(2次)浸泡进行样品脱水。室温下,每次2 min(用步骤3乙醇溶液)。
 

13.  空气干燥样品(或于干燥器中干燥)继续实验前应确证样品绝对干燥,样品放在加有干燥剂的玻片盒中,于-70℃干贮过夜。
 

14.  离心乙醇沆淀的反链及正链35S标记的核酸探针以及S-核糖核酸探针竞争物。沉淀干后,以5 μl 无菌的5 mmol/l DTT溶解沉淀。加2.5 μl(反应的半量)S-核糖核酸探针竞争剂于反链及正链核糖核酸探计中。

15.  100℃加热3 min,使探针变性。
 

16.  立即加足量杂交液A,使探针终浓度为0.3 μg/ml,充分混合。测定放射活性(期望放射活性计数值≥1×105 cpm/μl)。将管置 45℃水浴(杂交温度)。

 

17.  小心在标本上铺加适量探针(如用加样吸头,按20 μl/20 mm3 铺加,开始杂交)。

 

18.  置样品于加湿盒中(载玻片水平放置),加湿盒内加入加湿盒溶液A,于 45℃温育杂交适当时间。杂交时间可进行30 min~4 h(须平衡湿盒内液体并小心密封湿盒,因为如果样品干了,将导致高杂交本底出现,加湿盒溶液与杂交混合液的渗透压必须相同,以防止杂交液稀释或浓缩)。

19.  杂交过程最后一小时期间,准备并预热洗液A、B、C。

20.  开始洗玻片,将载玻片浸入55 ℃ 100 ml 洗液A中,立即放入玻片架并放入盛有溶液A的染色盘中。

 

21.  在55℃溶液A中洗2次,每次15 min 继续在55℃溶液B中洗2次,每次15 min。然后,室温下,以溶液C洗2次,每次2 min。
 

图一、杂交混合物在载玻片上的应用


22.  每一玻片上加500 μl RNA酶消化液,覆盖样品全部,将玻片放入加湿盒中(盛有水),标明RNA酶专用。室温放置15 min。


23.  在50℃洗液C中,缓慢振摇洗玻片2次,每次30 min。再于50℃洗液A中,缓慢摇洗玻片2次,每次30 min 继续在室温下,以2×SSC洗玻片2次,毎次5 min。
 

24.  经以下各组液体中(毎次2 min)进行脱水处理:50%乙醇 / 0.3 mol/l 乙酸铵、70%乙醇 / 0.3 mol/l 乙酸铵、90%乙醇 / 0.3 mol/l 乙酸铵、100%乙醇。


25.  空气中干燥载玻片。压胶片曝光至少过夜,然后进行乳胶放射自显影。

收起 
注意事项

1.  以上所有步骤均是将承有样品的载玻片置于玻片架中,并在盛有指定溶液的玻璃染色盘中进行,除非另有说明,所有溶液均为新配制,并只使用一次。

五分pk拾2.  碘乙酰胺和N-乙基马来酰亚胺为剧毒物,应小心操作。

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