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细胞培养常见问题及回答
点击次数:131 发布时间:2019-01-28

1.如何选用培养基?
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,shou选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养,各种目的无血清培养的shou选是AIM V培养基(SFM)。在开始进行新的细胞培养时,可以参考下表所列的条件:
细胞系 细胞类型 种 组织 推荐使用的培养基
293 成纤维细胞 人 胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清
3T6 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
A549 上皮细胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清
A9 成纤维细胞 小鼠 结缔组织 DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20 上皮细胞 小鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21 成纤维细胞 仓鼠 肾 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
BHL-100 上皮细胞 人 乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清
BT 成纤维细胞 牛 鼻甲骨细胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
Caco-2 上皮细胞 人 结肠腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA
Chang 上皮细胞 人 肝脏 BME, 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮细胞 仓鼠 卵巢 F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮细胞 大鼠 肝脏 F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮细胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK 上皮细胞 猫 肾 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
CV-1 成纤维细胞 猴 肾 MEM, 10% 胎牛血清
D-17 上皮细胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Daudi 成淋巴细胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
GH3 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴细胞 人 T细胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK 上皮细胞 仓鼠 肾 BME, 10% 小牛血清
HCT-15 上皮细胞 人 结肠直肠腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa 上皮细胞 人 子宫颈癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2 上皮细胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴细胞 人 早幼粒细胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮细胞 人 纤维肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA
HT-29 上皮细胞 人 结肠腺癌 McCoy's 5A, 10% 胎牛血清
HUVEC 内皮细胞 人 脐带 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ ml
I-10 上皮细胞 小鼠 睾丸癌 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴细胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮细胞 人 绒毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清
Jensen 成纤维细胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清
Jurkat 成淋巴细胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴细胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB 上皮细胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
KG-1 骨髓白细胞 人 红白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清
L2 上皮细胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清
L6 大鼠 骨骼肌成肌细胞 DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮细胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 马血清
McCoy 成纤维细胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清
MCF7 上皮细胞 人 乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰岛素
WEHI-3b 类巨噬细胞 小鼠 骨髓单核细胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38 上皮细胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清
WISH 上皮细胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清
WS1 人 胚胎皮肤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
XC 上皮细胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Y-1 上皮细胞 小鼠 肾上腺瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清

2.为什么要热灭活血清?
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。

3.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?
GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

5.为什么培养基中可以省去加酚红?
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

6.如何用台盼兰计数活细胞?
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升,在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。

7.如何消除组织培养的污染?

当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。
2 分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3 每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。
4 确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。
5 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6 重复步骤4。
7 在无抗生素的培养基中培养4-6代,确定污染是否以已被消除。

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
GIBICO的胎牛血清 没有预老化,储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清,避免反复冻融。

10.目录上说,Hank’s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?
Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。
 

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