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支原体检测三件事
点击次数:96 发布时间:2019-01-07

支原体是一类能自我复制的最小的原核生物,可透过一般过滤膜且对抗生素具有一定耐药性,是原代细胞跟传代细胞的常见污染物,其会改变细胞的 DNA、RNA 及蛋白表达。

 

支原体污染严重:?蒲醒д呙堑睦投?晒,早发现早处理,把损失降到最低。《药典三部 2015 版》-3301 支原体检验-要求应同时进行培养法和指示细胞培养法(DNA 染色法),也可采用国家检验机构认可得其他办法。这里笔者来简单介绍一下目前实验室常见的支原体检测方法:
 

1.培养法


培养法是通过将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖,然后再转接种到支原体固体培养基中,培养一段时间后(大约一个月),如果固体培养中出现典型的支原体菌落,则说明待测样品有支原体污染。
 

 

2、RD-RCA 恒温法(MycoBlue Mycoplasma Detector


吸取 1 ul 细胞培养上清液加入到反应体系中,孵育 小时,若细胞培养物被支原体污染,支原体 DNA 保守系列会被等温 DNA 聚合酶特异性扩增,使得反应液由紫色变成天蓝色。肉眼可观察。
 

 

3.荧光染色法(Mycoplasma Stain Assay Kit


该方法主要是能与 DNA 特异性结合的荧光染料 Hoechst33342 或 Hoechst33258,可使支原体内 DNA 着色,染色后可用荧光显微镜观察。
 

 

4.酶活法(TransDetect Luciferase Mycoplasma Detection Kit

 

支原体溶解时释放出来的酶与 TransDetect Luciferase Mycoplasma Detection Kit 中提供的底物发生催化反应,将 ADP 转化成 ATP,而 ATP 含量的上升,能通过生物发光化学反应检测,并通过分光光度计进行读数,从而达到检测支原体的目的。
 

5. PCR 法(Genloci-Mycoplasma Detection Kit

      

利用对支原体基因组中保守的编码域序列进行 PCR 检测的方法来进行支原体检测的。

 

江林生物的 Mycoplasma Detection Kit (支原体检测试剂盒)能够快速、准确地检测细胞培养中的支原体污染。试剂盒中的 Primers 是依据支原体基因组中高度保守法人 16SrRNA 编码域而设计的,只需简单的 PCR 反应就可检测 M.Arginini, M.Fermentans, M.Hyorhinis, M.Orale, M.Salivarium, M. Hominis, M.Pneumonia等常见的支原体。多年市场验证准确度和灵敏度。
 

 

除此之外还有相差显微镜法和电镜扫描法,不过,因其限制因素较大,在此不进行说明。

上述内容简单介绍了各种检测方法的原理,下面总结一下优缺点:
 

 

最后,单独使用目前市场上任何一种支原体检测试剂盒,都无法做到 100% 准确。严格的支原体检测,应至少使用二种及以上检验方法来确定检验准确性。

 

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